Pruefung 12. 11. 2007 15:30 - Innenhoersaal http://www.meduniwien.ac.at/user/wolfgang.huber/ Skripten (R. Schulte Hermann: kein Skriptum) Wolfgang Huber, Vortragende an IM1/Toxikologie, Ausnahme: Kundi student/lehre quasi-biographischer Zugang (wie wuerde einE jungEr WissenschaftlerIn an ein Problem herangehen?) 1. Literaturdatenbanken http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi Life Sciences - zumindest Abstracts reviews peer reviews f. Publikationen (cf invited papers) 2. Gendatenbanken 08. 10. 1. Huber-Einfuehrung07.pdf 09. 10. 2. Marian1.pdf 10. 10. 3. Huber-Grafik07.pdf 11. 10. 4. Parzefall.pdf 12. 10. 5. Gruschholzmann.pdf 15. 10. 6. Kundi.pdf 16. 10. 7. Marian2.pdf 17. 10. 8. Schulte-Hermann (kein Skriptum) 18. 10. 9. Breit.pdf 19. 10. 10. Knasmueller.pdf Papers: Fremdliteratur in Einleitung oder Diskussion "essentially as previously described" Fernleihe (Koeln ...) Retrospektivstudien, Prospektivstudien, Observationsstudien, Interventionsstudien Beispiel: Pleuramesotheliom > 20 a nach Asbest-Exposition Initiation - Promotion - Progression Gentoxische Mechanismen (DNA-Schaeden: z. B. kovalente Bindung an DNA) Nicht-gentoxische (meist auch nicht metabolisch aktiviert - z. B. Tumorpromot.), Epigenetische Mechanismen (Veraender nicht Basensequenz - z. B. Hypo-, hypermethylierung) Initiation oft/meist (aber nicht immer) ueber Gentoxizitaet Toxikodynamik (was macht Substanz mit Koerper) vs Toxikokinetik (was macht Koerper mit Substanz?) Aufnahme - Verteilung - Wirkung - Ausscheidung oft Aktivierung dirch Fremdstoffmetabolismus, ansonsten direkte Kanzerogene (Zytostatika ...) Problem: lange Latenzzeit bei Menschen (s. Asbest) z. B. Leber: Spenderleber; Operationsmaterial (um Tumor) -> aus Tierversuch "leichter" zu gewinnen gutartige Tumore, Foci - noch relativ "normales" Gewebe verdraengendes Wachstum boesartige Tumore - viele Veraenderungen Adenom/Carcinom Cancerogene koennen in allen Stadien angreifen ("komplette Cancerogene"), meist nur eine Phase (Initiation/Promotion/Progression) infiltrierendes Wachstum (Progression == Uebertritt gut- -> boesartig) Promotoren: - hyperkalorische Ernaehrung; - fettr. Kost; - (chron.) Entzuendungen; - Hormonwirkung; - Alkohol (minimal) Initiierte Zelle bleibt immer initiiert (groesseres Wachstumspotential), kann eliminiert werden, Promotion muss aber nicht erfolgen Progression: zahlreiche Phaenotypen, zahlreiche gentoxische Veraenderungen (dauert meist nicht lange - Heilung oder Tod) Phenobarbital in Studien (med.: Schlafmittel) - Lebertumorpromotor! Phthalate PPAR - Peroxisomal Proliferated-Activated Receptor fuer Leberkarzinom eher harmlos (keine Dauerexposition) Ames-Test - genet. Veraenderungen modifizieren Wachstum (-> durch Abzaehlen von Bakterien Genmodifikationen abschaetzbar) mut. Salmonellen (Rueckmutation mut. Typ -> Wildtyp) histidinfreies Medium - S. koennen kein H. synthetisieren Revertance - REV (nur 2 Tage Inkubation notwendig) Curare - in Blut toedlich, ueber Nahrung harmlos (Aufnahme ueber Magen-Darm-Trakt gering) Aktivierung (z. B.: erst mit S9-Mix (9000G-zentrifugiertes Lebermaterial) postive Tests) Toxikokinetik: Aktivierung/Entgiftung Chemopraevention nach DNA-Schaden - Reparatur Validitaet von Tierversuchen: die meisten therapeutischen, 60 - 70 % der Nebenwirkungen prognostizierbar in .at: 200000 - 400000 pro Jahr (Tendenz fallend) ~ 80 % Ratten und Maeuse (Primaten: z. B. wegen Contergan-Nonprognostizierbarkeit) Molekularbiologie - eher Maeuse Toxikologie - eher Ratten Kardiologie - mit Vorliebe Hunde weltweit mehr Tiere bei Routineverfahren als bei Tierversuchen getoetet (in .at LD50 verboten) kleiner Effekt -> viele Tiere (statistische Signifikanz ...) kleine quantitative Veraenderung -> Relevanz? Foci-Studien/Kanzerogenese 20 - 30 Tiere (symptomlose Tumorvorstufen - nach Faerbung im Lichtmikroskop sichtbar) methylenblau ... (cf dermatologische Perzeptionsprobleme) gegen Tierversuche - Replace, Reduce, Refine Procedere: VersuchsleiterIn, TV-Kommission der MUW, gesetzl. TV-Komm., Versuchsbeginn, Labor: Lontrollkommission zeitlich befristete Genehmigung Versuchsabbruch moeglich Schlachtung zum Organgewinn != Tierversuch IV schneller, billiger, weniger Tiere zu toeten; viel Datenmaterial (40 neg, 1 pos - ?) IV an: - Bakterien - frisch praeparierte SaeugerInnenzellen - Zellinien (Helen, FG2 ...) - Test ohne biol. Material - Sonderform: ex vivo (Entnahme von Material und Fortsetzung d. Versuchs im Reagenzglas) Statistik: Signifikanz; p-test, Student's t-test Assoziation != Kausalitaet (cf Storch-Publikationen) ... populaerwissenschaftliche Literatur Einreichen - Ersturteil (2 - 3 R) - revised Versions - Annahme/Ablehnung- Druckfahnen - Erscheinen Reviews meist anonym (mit Ausnahmen) major/minor revisions Status - preparation, submitted, in press/accepted ... -> quotes Impact factor (IF) einer Zeitschrift Zitierungen in 2 daraufolgenden Jahren IF = zitierte/publizierte Artikel cave abhaengig von Umfeld: 2 Arbeiten, 100 KollegInnen, davon 20 Zitate -> IF 10.0 (aber nur 20 % aus U.) 2 Arbeiten, 4 KollegInnen, davon 4 Zitate -> IF 2.0 (aber 100 % des Umfelds) Variationen - reiner IF, TOP 20 %/40 % Standard/40 % sub-Standard Habilitation - min 1 Top-Journal, 10 Pub, 2 Top == 1 Std -> Minimum 4 Top, 1 Std Nicht gewertet: letters, case reports, reviews, abstracts, Kapitel/Buecher, ... Indiv. Science Citation Index - Problem Anlauf, Selbstzitierungen ... (ISI) - je nach Fachbereich [10. 10. 2997] Marian - Dissertation traditionell 4 Semester, neuerdings 6 Semester N090 - .at Modell (4 Semester), PhD - 4-jaehrig jetzt: beide dreijaehrig "Applied Medical Sciences" N790 PhD: international akkreditierte Projekte N094 viele SWS - Propaedeutika; Tria Projektmanagement, Ethik, dotierte Stellen - FWF, NB -> jubilaeumsfonds Projekte passend zu Labor suchen ... Voraussetzungen unterschiedlich - Onkologie: breites Gebiet ... Ringvorlesung; 12+12+8+4+4 SWS Thesis Proposal Dissertationskomitee [Huber - graphische Praesentation] [11. 10. 2007 Parzefall - Computergestuetzte Literatursuche] Literatur vor 1966 ... "Graue Literatur" - Dossiers bei Behoerden, Firmen -> nicht in PubMed: Kontakte bei Firmen/Behoerden http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/ http://www.gopubmed.org/ http://scholar.google.com/ http://alephimc.zbmed.akh-wien.ac.at/ALEPH http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/ EC/RN -> Substanzen nach Chemical Abstracts nih substance search Dental amalgam -> 8049-85-2 10102-43-9[EC/RN Number] "BOUTWELL RK"[Author] "BOUTWELL RK"[Author] AND ("1960"[PDAT] : "1970"[PDAT]) ubmed imp.ac.at billrothhaus.at onb zbp hsdb - hazardeous substances database toxnet.nlm.nih.gov [12. 10. 2007 grusch/holzmann - gendatenbanken] - Biologische Genkarten - cM == Centimorgan - phsy./molek. Gen-karte - Restriktionsfragmente - Sequenzreaktionen Francis Collins vs Craig Venter (Celera) Genmom: 30 % Gene, davon 10 % kodierend -> 2 - 3 % Protein- o. RNA-kodierend [Pseudogene: oft intronless, Rueckintegration aus cDNA?] ges ~ 3E9 bp Sequenzierung: Shotgun-Verfahren: 2-3kbp -> contigs -> 10-50kbp Problem: hohe Fehlerrate, repetitive Elemente Sabnger-Coulson -> Floureszenzfarbstoff mehrfache Sequenzierung zur Fehlerkorrektur STS: sequence tagged sites, wichtiger: EST: expressed sequence tags (kurze cDNA Stuecke - von Transkripten rueckuebersetzte copy-DNA (reverse Transkriptase, etwa aus Retroviren)) -> Klone real bestellbar (Yeast artif Chrom, p1 bacteriophage chromosome - YAC, PAC) Komplexitaet der Gene auch und vor allem durch posttranslationale Veraenderungen, Spleissen etc. determiniert (Zahl bei Tieren, Pflanzen aehnlich ...) SINE/LINE: (short/long interspersed nuclear element): Ueberreste von Retroviren? (r-Transkriptase ...) wichtig: SNP (Single Nucleotide Polymorphism): Unterschiede! (Reaktion auf Medikament, ...) ~ alle 1000 bp Transkriptom (Gesamtzahl transkribierter mRNA): Gehirn ~ 23500, rest ~ 12000, Herzmuskelzellen < 10000 James Watson: indiv. Genom ueber Cold Spring Harbor publiziert, ebenso Craig Venter derstandard.at/?id=3020373 http://biology.plosjournals.org/perlserv/?request=get-document&doi=10.1371%2Fjournal.pbio.0050266&ct=1 (pdf ...) Datenbanken: http://www.oxfordjournals.org/nar/database/cap/ NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Sitemap/index.html OMIM - Erbinformation -> Krankheiten Vergleich: Blast (ebenf. NCBI) - Swissprot (-> Expasy) http://expasy.org/people/swissprot.html Human Protein Reference Database - http://www.hprd.org/ [Kundi 15. 10. 2007] Studientypen: experimentell: - klinische Studie - Tierversuch - Zellkuluter Beobachtungsstudien: - Kohortenstudien -> RR == relatives Risiko prospektiv: Personen "gehen verloren" ... lange andauernd (Jahrzehnte/Generationen) retrospektiv: wenn Exposition in Vergangenheit gut dokumentiert (Arbeitsplatz: Asbest ...) - Fall-Kontroll-Studien: Faelle + aehnliche Vergleichsgruppe suchen -> Odds Ration OR Risiko: Fehlklassifikation - Querschnitsstudien - Fallberichte, Fallreihen (seit 15./16. Jh, seltsame Inzidenzen) Kaplan-Meier-Diagramme Oekologische Studien Nachteil: genaue Exposition nicht feststellbar (Stoerphaenomene - nicht Exponierte koennten ander Risikofaktoren haben) Nominal-, Ordinal-, Intervall-, Rationalskala Tumorforschung: - unabh.: oft nominal (Art, Substanzklasse ...) intervall/rational: Dosis, Konzentration ... - abh.: meist rational (Anzahl Revertanten, Mortalitaet, Tumorgroesse ...) Binomial-, Poisson-, Normalverteilung (linear, logarithmisch) Hypothesenpruefung: alpha vs (1 - beta) [16. 10. 2007 Brigitte Marian] In vitro Experimente mit Zellen, Enzymmessungen - Kurzversion eines Diss-Seminars + Praktikum (Anmeldung per E-Mail) Zellkulturgewinnung: Gewebe um Zellen aufloesen (Trypsin, Kollagenase, Hyaluronidasezellen, Dispase) Uneinheitliche Population -> durch Bedingungen selektionierbar voellige Einheitlichkeit nur durch Klonieren CO2-Puffer (Zusatz ausser bei Fibroblasten: Hefes) glutamat: zerfaellt zu ammoniak ... fibroblasten - foetales kaelberserum (pdg, tgf-beta, insulin u. ae., ...) insulin, platelet-derived growth factor ... globulinfraction: proteaseinhibitoren plastik Primaerkultur -> Sensezenz (Krise): keine Telomere -> p53 inhibiert (irreversibler wachstumsblock); - bei Nagern spontan ueberwindbar (Zellinie) - Tumorviren: Simian Virus 40 (SV40), HPV Teile davon koennen p53 und Retinoblastom behindern (-> daher Tumorrisiko bei HPV) - myc-onkogen aus Geweben mit unbegrenzter Teilungsfaehigkeit (Haut, ...) in vitro Beobachtung von Tumorzellen: CAVE Abschaltung unwichitger Rezeptoren primaere Zellkulturen: nicht passagiert Material: mm3 bei Biopsien, evtl cm3 bei grossen Tumoren -> begrenzt Transfektion: - Ca-Praezipitation: DNA + CaCl2 -> Niederschlag bedeckt Zellen -> Makrozytose: Aufnahme von DNA + Kristallen - Elektroporation: mit Elektroschocks Poren schaffen (1 bis 70 % ueberleben) - Lipofection (Liposomen): kationische Tenside (t-Amine) (industriell: Faerbemittel -> Oberflaechenniederschlag) si-oligos (dna/rna), reporter aces(?) -> Selektion Expression: - konstitutiv Citomegalie (CMV), SV40, Large Terminal Repeats (LTR) - konditionell (Oestrogenabh., Metallabh., Tetracyclinabh.) - gewebespezifisch (bei transgenen Embryos/Tieren ...) Reporterkonstrukte (z. B. Luziferase, beta-Galctosidose, GFP - fluoreszierend) Karzinomzellen im Gegensatz zu Adenomzellen in Agarmedien vermehrungsfaehig oft kleiner, abgekugelter, Verlust der Kontaktinhibition (einschichtiges Wachstum ...) weniger abh. v. Wachstumsfaktoren (FCS ...) Wachstum: exprimierte Farbstoffe zur Zellzahlbestimmung (MTT, Neutralrot (Plaques-Tabletten)) Floureszenzzaehler -> Diagramme Zellzyklusverteilung -> Kinaseinhibitor: viel mehr G1 als S (G1 haploid, G2 diploider Chromosomensatz) Zelltod - Nekrose vs Apoptose (Fraktionierung, Phagozytose) Detektion Apoptose: - DNA-Fragmentierung: Elisa (Nucleosomen + DNA) - einfacher/sicherer: 3'-DNA-Detaktion - Keratinabbau (caspaseninduziert) - Phosphatidylserin an Aussenseite (Annexin V) (+ Propidiumiodid zur Unterscheidung von Nekrose) - Mitochondrientracer (bei Tyrosinkinase nicht verwendbar) Migration: Scratch Test Boyden Essay: 2-Kammer-System mit Filter (grobporig, ~ 8 um) evtl auch unterschiedl. Effektoren oben/unten Zellen wachsen von oben nach unten -> Fallen/Kleben ... Filter durch organisches Material ersetzbar -> klastische Wirkung ueberpruefbar (gewebezerstoerung - Kollagen, ...) ELISA extrazellulaere Matrix [17. 10. 2007 Schulte-Hermann: Tierversuche] - gesamten Organismus betrachten - Toxikologie/Pharmakologie (non-clinical drug safety - Versuche vor Erprobung an Menschen; clinical "" - Menschen) - Metabolismus - Pharmakokinetik - (Neben-)Wirkungen: Halbwertszeit ... Aufnahme - Metabolismus - Abbau - Ausscheidung - nicht immer vergleichbar: Stoffwechselunterschiede (bei groesseren Tieren eher langsamer) -> Ermittlung der Pharmakokinetik am Menschen nach Tierversuch Entgiftung vs Toxikokinese (CCl4) -> Messung toxischer Metaboliten: Zelltod ... Phasen der klinischen Pruefung: 1. Pruefung an Freiwilligen (bisweilen aus ethischen Gruenden wegen bekanntet Nebenwirkungen nicht moeglich) - Steigerung der Dosis, bis Wirksamkeit beobachtet wird - Nebenwirkungen: toxische Metaboliten 2., 3: Wirksamkeit (Doppelblindstudien), untersch. gr. Gruppen (gegen Placebo, gegen/mit erprobtem Medikament) 4. behoerdliche Pruefung der Testdokumentation ("Lastwagen von Aktenordnern ...") "Pharmakovigilanz" - Beobachtung nach Markteinfuehrung (Wirksamkeit, unerwuenschte Wirkungen) -> nach REACH (Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction of Chemicals) in EU auch fuer andere Chemikalien notwendig: in vitro/in vivo-Versuche transgene Tiermodelle ("Knock-out-Maeuse") -> mehr Tierversuche (PN 2006) Tierversuchsgesetz (.at) - Qualifikation: AerztIn/VetMed/BiologIn und Labor - Ethikkommission (MUW - freiwillig, gesetzlich) - Belastungskategorien (leicht/mittel/schwer) - manche Eingriffe (wachgehirnuntersuchungen ...) verboten oder kaum bewilligbar unangemeldete Kommissionsbesuche Spezies - (Drosophila: kaum mehr ...) - Bakterien - Mutagenitaet, evtl Pilze, Zellkulturen (Chromosomenaberrationen ..., Knochenmark eines lebenden Organismus (f. Arzneimittelpruefung)) Pharmakokinese - Ratten, Maeuse; Hunde (nicht an Unis) - Kreislauf aehnlich Kaninchen: 1954 - 1962 - Contergan (Thalidomide) - Lenz: Organbildung - kaum reproduzierbar ausser bei Affen und Kaninchen - kaum Dosis-/Wirkungszusammenhang Erkenntnis: Integrine -> Zellerkennung blockiert: Leprabehandlung; Nebenwirkung Muedigkeit ... - Lethale Dosis bestimmen/abschaetzen Mutagene Versuche: in vitro - meist keine Tierversuche notwendig (Cancerogenitaetsstudie 3 - 4 Jahre, erst in Phase 3) [18. 10. 2007 Paul Breit - Wissenschaftliche Fotographie] standardisierte Qualitaet Massstab/Objektmikrometer reproduzierbare Beleuchtung Transparenzen: Leuchtkasten fixe Brennweite -> stets gleicher Abbildungsmassstab MF (um nicht den Deckel zu fokussieren ...) Nachbearbeitung digital vs analog D: Weissabgleich! Kontrastumfang geringer DNG von Adobe als offener Standard statt RAW/NEF/CR2 vorgeschlagen etc. (CAVE http://www.openraw.org/node/1482/531) Farbmodus RGB/CMYK sRGB (small RGB) Praeparate rechtzeitig aufnehmen (Verblassen, Kratzer, Staub ...) indirektes Durchlicht Stativaufnahmen: Beleuchtung mit ~ 45 o Einfallwinkel, schwarzer Karton um Objektiv, evtl Schriftzuege/Markierungen abdecken Ringblitz, Schwanenhalsleuchten, Diffusoren Glasplatte, um Schatten auszuweichen Kartonbug (Tiere) Mikroskopie - Beleuchtung (Hellfeld, DUnkelfeld/Interferenz/HMC, Fluoreszenz) Trockenobjektiv/Immersion (evtl Deckglaskorrektur) Kuehlung fuer Fluoreszenzaufnahmen (Rauschverminderung) heute Objektive mit groesserem OO-Abstand (Fertilisation) Fluoreszenz (kleine, helle Objekte): evtl unterbelichten/Spot-Messung Wuerfel: Anregungsfilter, Dichromatischer Teilspiegel, Sperrfilter evtl. Mischbilder Durchlicht + Fluoreszenz (oder digital zusammensetzen) FRET: fluorescence resonance energy transfer TIRF (internal total reflection) (CFP == cyan fluorescence protein, YFP == Yellow fluorescence protein) Laser Scanning fluorexcence microscopy Zeitraffer (evtl externer Trigger) [19. 10. 2007 Knasmueller: Schreiben wissenschaflticher Arbeiten] papers; Diss/Dip; Gutachten "full length papers" - Verlage, Vereinigungen gute Zeitschriften: auch bei Ablehnung immerhin qualifizierte Reviews Onkologie: allgemeine, organspezifische Zeitschriften Literatursuche: Artikel nicht nur auf Grund der abstracts beurteilen - introduction/discussion auf weiterfuehrende Hinweise/Stichwoerter durchsuchen! ausfuehrliche Literaturliste (CAVE Animositaeten bei Vergessen ...) Bilder: je 1 Seite, Titel, legends + table of legends significance (*), sd, Achsenbeschriftung -> guidelines (list of) abbreviations: in abstract vermeiden auch im Falle einer Auflistung bei erster Erwaehnung ausschreiben Proportionierung - keine zu langen Einleitungen, allgemein Bekanntes kurz fassen, keine Resultate/Methoden in der Einleitung! Empfehlung: "huebsche" Saetze (evtl mit leichten Veraenderungen) uebernehmen Materials/Methods: Massangaben auch mit Standardabweichung demographische Eigenschaften bei Methoden Beschraenkung auf Differenz zu Standardmethoden, aber Durchfuehrungszyklen (Wiederholungen, Zellzahlen ...) auf standardisierte Richtlinien berufen Lieferung, Kalibrierung, Lagerung Keine Erwähnung von Ergebnissen anderer Studien Resultate - Vorexperimente, Hauptexperimente; kolloquial (nicht zu trocken, aber offensichtliche Details in Tabellen nicht ueberstrapazieren) evtl Eichkurven, (positive) Kontrollexperimente Tabellen nach beschreibendem Text keine abgeleiteten Werte (prozentuelle Anstiege): immer (auch) absolute Werte samt Einheiten publizieren Discussion -> Interpretation - nur tatsaechliche Ergebnisse, ANregung weiterer Untersuchungen, Spekulationen - keine absoluten Aussagen Konsequenzen zum Schluss: Abstract, aehnliche Struktur wie Gesamtarbeit (Ziel, Methoden, Ergebnisse, Schluesse) Qualitaetskriterien, zahlenmaessige Effekte, Dosis von Versuschssubstanzen ... ungenaue Formulierungen ("stark erhoeht", "slightly decreased") vermeiden haufigste Fehler - schlechte Sprachbeherrschung, zu lang online submission centers Reviews genauestens (Satz fuer Satz) beachten: point by point response queries bezueglich layout/typographie/figures/quotes ... Letters to the editor: heute freundlicher (CAVE wechselseitige reviews ...) Reviews - akademisch weniger verwertbar, aber nicht zeitkritisch (Knasmueller: schrieb Arbeiten teilweise lieber selbst, als auf Studierende zu warten) Abschaetzung: 80 - 200 Publikationen fuer 1 Review (und keine aktuellen Reviews publiziert ...) Zusammenfassung, Hypothese Buchkapitel Dip/Diss - Unterkapitel Schemata Appendix -> Einzeldatensicherung Zitierregeln englischer Abstract Gutachten - aehnlich review: Stand der Technik recherchieren (Datenerhebung, -auswertung, Referenzen)